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近年来，随着单细胞技术的蓬勃发展及其在各个科研领域的广泛应用，越来越多的组学技术被加入到单细胞检测的大家庭中来。2017年，纽约大学的Rahul Satija教授团队在Nature Methods发表了题为“Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells”的论文，文中提出了一种基于测序同时检测单细胞转录本与表面蛋白的新技术，实现了单细胞维度下的蛋白质信息与转录组信息的整合。
图1 CITE-seq相关文章统计（来源：PubMed)
接下来，本文就以基于10x Genomics Chromium平台的单细胞表面蛋白测序+scRNA-seq多组学技术为例，依次从技术概况、核心原理&实验流程、数据分析策略、应用领域及案例、样本准备及运输注意事项等方面，为您详细介绍和解析CITE-seq技术。
技术概况
什么是CITE-seq多组学技术？
CITE-seq全称为“Cellular indexing of transcriptomes and epitopes by sequencing”，该技术可以在单细胞水平将基因表达信息与细胞表面蛋白信息通过测序的方法联合起来，达到同时检测细胞表面的蛋白质信息与胞内转录组信息的目的。该技术相较于单独的单细胞转录组测序而言，额外地加入了细胞表面蛋白的表达信息，再联合同一细胞内的转录组信息，可以更加深入地区分细胞异质性、更精确地挖掘特异性的细胞类型，探索治疗耐药性等生物学现象背后的机制。
图2 CITE-seq实现的单细胞蛋白信息与转录信息获取示意图
核心原理&实验流程
如何实现转录组和表面蛋白的同时检测？
百奥智汇的单细胞转录组+表面蛋白测序是基于10x Genomics Chromium系统进行的。该技术的基本实验流程包括：组织解离，抗体孵育、细胞悬液制备，加条码和文库构建、高通量测序、数据分析和可视化报告。
具体而言，本技术在制备单细胞悬液前，需要采用工程化的Biolegend TotalseqTM系列抗体对细胞进行孵育，完成细胞表面目标蛋白的捕获过程，再洗去未能顺利结合的剩余抗体，得到细胞表面有特异抗体结合的细胞悬液。然后，与10x Genomics的单细胞转录组测序流程基本一致，同样是经过质检，确保细胞悬液的质量达标后，将悬液和建库试剂加入芯片，进行上机。基于Chromium系统的微流控技术，可将单个细胞与带有条形码和引物的凝胶珠包裹到微液滴中，完成单个细胞mRNA捕获以及抗体上所携带的寡核苷酸序列的捕获。之后再通过PCR扩增，对由mRNA反转录而形成的cDNA文库与“表面蛋白”文库进行构建。构建完的两种文库经过高通量测序，即可进行数据分析。
图3 CITE-seq的基本实验流程
本技术的核心体现在该实验流程的抗体孵育与Chromium系统的微流控技术，这两个过程的核心原理是该多组学技术同时实现单细胞表面蛋白信息序列化与单细胞转录本条码化的基础。首先，在抗体孵育的过程中采用了抗体-寡核苷酸复合体来对单细胞悬液进行孵育。抗体通过二硫键将抗体本身与DNA标签连接起来。而该DNA标签包含三部分功能不同的序列：1、用于后续扩增的PCR引物结合序列；2、用于区分不同种类抗体的Barcode序列；3、用于后续被捕获的Poly（dA）序列。其次，该技术在上机经过微流控技术平台后，形成了单细胞组成的油包水体系，体系中加入的胶珠不仅可以捕获单细胞中的差异mRNA，还可捕获抗体上携带的寡核苷酸序列。通过上述原理将表面蛋白信息序列化与单细胞转录本条码化，实现了以不同的DNA序列标记不同单细胞的不同表面蛋白，以及捕获来自不同单细胞的转录本的目的。在后续的实验流程中，包含蛋白信息的序列文库与单细胞cDNA文库则分别完成构建，最后通过高通量测序与数据分析过程，完成单细胞表面蛋白与单细胞转录本的数据可视化。
图4 抗体-寡核苷酸复合体结构示意图
图5 捕获mRNA的Gel Bead序列结构
数据分析策略
如何对CITE-seq数据进行分析？
CITE-seq数据囊括蛋白与转录组信息，能将细胞的免疫表型与基因表达联系起来，能更精准地实现细胞亚群或罕见细胞类型的注释。其中，转录组学的分析与正常scRNA-seq数据一致，而蛋白质数据则可以根据选定的蛋白质信号（ADT）对转录组数据获得的分群结果进行进一步细分，将基因表达相似、蛋白表达存在差异的异质性细胞进行区分。
图6 转录组和蛋白质数据对比
应用领域
肿瘤发育、免疫治疗与病理研究等领域
应用实例：
血液病的致病机理与防治
如前文所介绍，CITE-seq满足了我们在单细胞水平下同时对蛋白信息与基因表达信息的同时检测，蛋白信息与核酸信息的联合不仅可以让我们获得更深层次的数据挖掘，还可以使该检测数据更加全面和可靠。在2020年，来自辛辛那提儿童医院医疗中心的Nathan Salomonis教授团队在Nature上发表了以“Mouse models of neutropenia reveal peogenitor-stage-specific defects”的研究性论文。该研究中，作者首先建立了突变小鼠模型，再结合CITE-seq与scATAC-seq技术，解析了GFI1突变导致的儿童重型先天性中性粒细胞减少症（SCN）的致病机制。在小鼠模型中，用功能实验证实了GF1突变的致病作用，再利用流式、CITE-seq对中性粒细胞生成过程中的状态转化进行了分析，展示出正经历种终末粒细胞生成的细胞亚群的标志基因表达差异、表面蛋白相关基因表达差异、细胞周期相关基因表达差异。其次，作者从CITE-seq的测序结果中进一步挖掘各细胞亚群的表面蛋白表达水平，发现粒细胞标志物LY6G的表面蛋白表达与潜在的转化过程不一致，在中性粒细胞祖细胞和未成熟嗜中性粒细胞之间形成重叠。最终，作者通过Cell Harmony算法与scATAC-seq技术验证了GF1突变导致的染色质缺陷与一系列分子功能障碍。
图7 该研究的路线
总而言之，该研究通过多种单细胞技术解析了GFI1突变导致的儿童重型先天性中性粒细胞减少症（SCN）的致病机制，发现该突变会阻止血细胞发育，包括影像中性粒细胞形成。通过建立小鼠SCN模型，证实了GFI1突变的致病作用，而且也确定了突变GFI1在细胞发育周期的每个阶段如何影响中性粒细胞。这些数据使人们能够成功治疗和部分挽救SCN模型中的中性粒细胞，为开发相应的新疗法提供新的思路和理论。该研究也成为了一个CITE-seq多组学技术与scATAC-seq技术联合应用的应用示范。
图8 各细胞亚群的Marker基因表达与表面蛋白表达热图
样本准备及运输注意事项
如何准备一个合格的单细胞转录组样本？
目前，百奥智汇可承接基于10x Genomics的单细胞转录组实验和分析，接收多种类型的组织，包括组织样本、血液样本和细胞样本。良好的样本准备流程及运输过程对该实验的成功至关重要，因此我们总结了一些样本准备流程和运输注意事项，希望能够对本地（北京、广州及上海）及外地客户的课题研究提供帮助。
组织、血液及细胞等新鲜样品的样品准备
✦新鲜组织：取至少250mm3体积的样品量，使用1640培养基、PBS缓冲液或生理盐水清洗2-3遍（客户也可以根据自己组织的情况，选择适宜培养基清洗；对于肿瘤等不易沾染血液的组织也可以不清洗）。在30分钟内完成对样品的初步处理后，置于5 mL的组织保存液（美天旎），组织需要完全浸没于组织保存液中。保存液需提前置于4℃中预冷。
✦新鲜血液：取至少3mL体积的样品量，迅速置于EDTA抗凝管中4℃保存。
✦消化细胞悬液、细胞系：取至少1×106个细胞（可根据细胞浓度计算），取后置于已提前4℃预冷含10%血清的PBS缓冲液中，4℃保存。
样品寄送
本地及外地客户：冰上（保持低温运输 4℃-16℃）快递至百奥智汇。
注意事项
✦组织不应直接置于液氮中，因为温差可能导致组织表面沸腾，导致鼓泡和不均匀冻结。这可能会造成组织破裂和形态损伤。
✦可用锡箔纸包裹组织放入冷冻瓶，并放入棉花填充瓶子空隙以防止运输过程中的震动造成样本损坏，注意棉花填充适量，不要挤压到样本。
✦为了防止组织样本的蒸发和脱水，速冻组织样本必须储存在密封的容器中。
如果您对CITE-seq多组学技术等相关内容感兴趣，请关注百奥智汇公众号（Abiosciences），联系我们。
参考文献：
Stoeckius M, Hafemeister C, Stephenson W, et al. Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells[J]. Nature methods, 2017, 14(9): 865-868.
Muench D E, Olsson A, Ferchen K, et al. Mouse models of neutropenia reveal progenitor-stage-specific defects[J]. Nature, 2020, 582(7810): 109-114. |
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发表于 2022-12-13 08:03:29