项目文章 | 单细胞技术绘制结肠粘膜成纤维细胞图谱

台敬协

2022年12月，四川大学华西医院莫显明教授团队在communications biology发表了题为“An integrated map of fibroblastic populations in human colon mucosa and cancer tissues”的研究成果，本研究通过单细胞转录组测序(scRNA-seq)建立了人结肠粘膜和结肠癌的单细胞图谱，揭示了人健康结肠粘膜和结肠癌组织中基质细胞的异质性，对探究在不同的生理和病理条件下结肠黏膜的完整性和稳态是如何维持，以及结肠癌细胞是如何生存和发展的提供了理论依据。
新格元在该研究中承担了部分文库构建及单细胞转录组(GEXSCOPE®)测序等工作。

下面和元小新一起来看一下吧~

研究背景

成纤维细胞和肌成纤维细胞在结肠健康和疾病中协调各种功能，并在稳态维持、上皮生长和修复、免疫反应、炎症、纤维化、肿瘤发生和癌症进展中发挥关键作用。成纤维细胞和肌成纤维细胞也是肿瘤组织中的主要基质细胞。成纤维细胞是癌症的主要基质成分，被称为癌症相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts，CAFs)。CAFs是活化的成纤维细胞，已被证明是肿瘤间质编程的关键成分，并支持癌症进展和转移。该文章描述了在结肠癌组织中成纤维细胞和肌成纤维细胞类型发生改变，阐明了人结肠粘膜和结肠癌组织中基质细胞的细胞异质性，以及其在不同的生理和病理条件下如何维持结肠黏膜的完整性和稳态，还揭示了结直肠癌细胞是如何生存和发展的。

文章亮点

1、利用单细胞测序技术针对人结肠粘膜和结肠癌组织中的成纤维细胞和肌成纤维细胞进行了详细分群，发现其组分异质性；
2、结合免疫荧光技术进行定位，观察成纤维细胞和肌成纤维细胞在人健康结肠粘膜和结肠癌组织中的分布差异。

思维导图



研究方法

本文构建了一个包含8935个成纤维细胞图谱，来源于12例接受了结肠切除手术的结直肠癌患者，正常组织取样于距离癌变组织至少10厘米的部位。通过荧光激活细胞分选(FACS)对9例患者的结肠粘膜和结肠癌细胞悬液进行分选，以富集CD326-、CD45-和CD31-细胞群。从另外3对标本中筛选出CD45-分选的结肠黏膜细胞和结肠癌细胞，用Singleron GEXSCOPE®单细胞转录组测序试剂生成单细胞标记cDNA文库进行测序。

研究结果

1.人结肠粘膜中成纤维细胞和肌成纤维细胞的单细胞图谱
经过分选后，排除了非成纤维细胞群，分析了8935个来自人结肠粘膜样品的成纤维细胞，分成了11个细胞簇。所有细胞簇均表达VIM，S100A4和COL1A1。其他经典的成纤维细胞标记基因如DCN、ACTA2、FAP和PDGFRA在几个亚群中高度表达。根据标记基因表达模式的相似性，这些簇可分为三个群体，包括表达OGN、表达CXCL14的成纤维细胞和表达RGS5的肌成纤维细胞。在表达CXCL14的成纤维细胞中，有一小部分细胞具有不同的基因表达。鉴定出HHIP+肌成纤维细胞和CCL19+成纤维细胞。



Fig 1. 通过scRNA-seq鉴定出人结肠粘膜中成纤维细胞和肌成纤维细胞的类型

每个成纤维细胞亚群都有特定的基因表达谱，尤其是在细胞外基质、细胞因子和生长因子中，表明每个亚群具有不同的生物学功能。总的来说，以上结果揭示了人结肠粘膜中成纤维细胞和肌成纤维细胞的多样性。



Fig 2. 人结肠粘膜成纤维细胞和肌成纤维细胞基因表达谱的模式

2.人结肠粘膜成纤维细胞和肌成纤维细胞群之间的分化发育关系
接着，作者通过使用Monocle探索了成纤维细胞和肌成纤维细胞之间的分化发育关系。轨迹分析表明，肌成纤维细胞和成纤维细胞聚集成5种状态，另外，表达分析结果还显示了ATF3、TCF21等一系列转录因子在伪时间过程中的动态表达变化。
人结肠黏膜中OGN+PI16+成纤维细胞独立于其他肌成纤维细胞和成纤维细胞群，分布在时间轴的起始端。而RGS5+肌成纤维细胞分布于伪时间轴的终末端，CXCL14+细胞群排列在OGN+和RGS5+肌成纤维细胞之间，CXCL14+ADAMDEC+成纤维细胞与表达OGN的成纤维细胞有一定的相似性。其余CXCL14+细胞群：CXCL14+NRG1+、CXCL14+VSTM2A+、CXCL14+INHBA+、HHIP+成纤维细胞和肌成纤维细胞，大部分细胞处于过渡状态。CXCL14+INHBA+群体在伪时间轴上与RGS5+肌成纤维细胞接近，提示两者之间可能存在分化关系。



Fig 3. 人结肠黏膜成纤维细胞和肌成纤维细胞的运动轨迹分析

3.结肠癌组织中的成纤维细胞和肌成纤维细胞
接下来，作者分析了来自12个人类结肠癌组织样本的10986个细胞。在联合分析中，发现癌症相关的肌成纤维细胞和成纤维细胞的细胞群与人类结肠粘膜中的肌成纤维细胞和成纤维细胞的高度相似。肿瘤组织中OGN+成纤维细胞群急剧减少，主要与癌症相关的肌成纤维细胞和成纤维细胞，包括表达RGS5的肌成纤维细胞和表达CXCL14的成纤维细胞。在结肠癌组织中，表达RGS5的肌成纤维细胞、表达CXCL14的肌成纤维细胞和HHIP+肌成纤维细胞中显示细胞外基质基因，包括胶原基因的广泛上调。此外，癌组织中的成纤维细胞和肌成纤维细胞被改变，表达一系列基因的水平升高，包括BMP、Wnt配体、趋化因子、趋化因子配体。以上结果表明，肿瘤组织中的成纤维细胞和肌成纤维细胞是基质组织的活性成分，支持肿瘤的生长转移，并调节肿瘤组织中的炎症反应和细胞增殖。



Fig 4. 人结肠粘膜和结肠癌组织中成纤维细胞和肌成纤维细胞的联合分析

4.人结肠粘膜和结肠癌组织中的肌成纤维细胞
为了验证成纤维细胞和肌成纤维细胞的类型，作者使用抗人CD31、CDX2、Cytokeratin 20和CD45抗体对样本组织中的血管内皮细胞、炎症细胞和上皮细胞或癌细胞进行染色。结肠黏膜和结肠癌组织中用抗人RGS5、decorin、podoplanin/gp36、CD36、α-SMA和HHIP抗体显示成纤维细胞和肌成纤维细胞。
HHIP+肌成纤维细胞同时表达ACTA2和趋化因子CXCL14，并特异性表达HHIP，这些肌成纤维细胞还表达典型的WNT配体WNT2B和SOSTDC1，可溶性BMP和WNT拮抗剂。免疫染色显示，在人结肠黏膜中，表达HHIP蛋白的肌成纤维细胞稀疏地位于结肠隐窝底部。与人结肠黏膜相比，结肠癌组织中HHIP+肌成纤维细胞的比例没有改变。结果表明，HHIP+肌成纤维细胞可能适应并响应调节癌细胞增殖和调节癌症组织中的免疫反应。HHIP染色一致显示肌成纤维细胞分布稀疏，靠近癌细胞。α-SMA染色显示，RGS5+CD36+、RGS5+ACTA2hi、HHIP+肌成纤维细胞为梭形细胞，紧附于上皮细胞下方，环绕结肠隐窝，由上皮下基质细胞组成。在癌组织中α-SMA染色显示肿瘤细胞周围有大量阳性肌成纤维细胞，CD36hi肌成纤维细胞比例显著降低。



Fig 5. 人结肠黏膜成纤维细胞和肌成纤维细胞的免疫荧光染色

5.在结肠粘膜和结肠癌组织中主要产生细胞外基质的成纤维细胞群
OGN+PI16+成纤维细胞表达高水平的细胞外基质蛋白decorin(DCN)。DCN染色显示DCN存在于结肠隐窝和血管周围的细胞外基质中。在结肠癌组织中，三种OGN+成纤维细胞均高度减少。由于DCN主要在OGN+成纤维细胞中表达，因此，在结肠癌组织中，DCN染色也显著减少，且未包围任何癌细胞。



Fig6. 人结肠癌组织成纤维细胞和肌成纤维细胞的免疫荧光染色

6.成纤维细胞群在人类结肠粘膜和结肠癌组织中主要细胞因子
CXCL14+成纤维细胞和肌成纤维细胞亚型主要产生分泌因子。其CXCL14+ADAMDEC+成纤维细胞主要产生7种以上的趋化因子和趋化因子配体。这些趋化因子和趋化因子配体已被证明以不同的方式调节炎症反应。因此，基因表达谱表明CXCL14+ADAMDEC+成纤维细胞的主要功能是调节人结肠粘膜炎症。CXCL14+NRG1+成纤维细胞，被发现分泌BMP2、BMP4、BMP5和非典型WNT配体WNT5A(图2c)。这种类型的成纤维细胞也表达NRG1、VEGFA、CSF1和IGFBP3。CXCL14+NRG1+成纤维细胞分泌的所有因子已被报道对上皮细胞、血管细胞和神经细胞发挥多方面的保护作用，并已被证明具有改善结肠黏膜稳态破坏的抗炎作用，这表明CXCL14+NRG1+成纤维细胞可能维持人类结肠黏膜的细胞稳态。CXCL14+VSTM2A+成纤维细胞的基因表达模式与CXCL14+NRG1+成纤维细胞相似。它们表达了较高水平的BMP4、PDGFD、FGF9、V-Set、跨膜结构域含2A(VSTM2A)、ALK和LTK配体2(alk2)，提示成纤维细胞群体可能参与细胞增殖和转化的调节。CXCL14+INHBA+成纤维细胞，表现出基因表达的大量激活，并分泌BMP1、BMP2、BMP4、非典型WNT配体WNT5A、典型WNT配体WNT2和WNT4、VEGFA和INHBA。这些成纤维细胞还表达细胞因子和趋化因子IL32、CXCL1、CXCL2、CXCL8和CXCL14，并产生细胞外基质蛋白，包括胶原蛋白。基因谱分析结果显示CXCL14+
INHBA+成纤维细胞的基因表达被高度激活，并且这种类型的成纤维细胞与之前鉴定的激活成纤维细胞高度相似。
总之，作者鉴定出存在于人结肠黏膜和结肠癌组织中11种成纤维细胞和肌成纤维细胞，包括OGN+PI16+、OGN+IGF1+、OGN+KCNN3+、CXCL14+ADAMDEC1+、CXCL14+NRG1+、CXCL14+VSTM2A+、CXCL14+INHBA+、HHIP+、RGS5+ACTA2hi、RGS5+CD36+和CCL19+成纤维细胞和肌成纤维细胞。



Fig 7. 人结肠粘膜和结肠癌组织中的成纤维细胞群

结论
作者系统地描绘了成纤维细胞和肌成纤维细胞的细胞图谱，并强调了人类结肠粘膜和结肠癌组织中基质细胞的细胞异质性。未来的细胞方法可以开发成纤维细胞和肌成纤维细胞，以了解在不同的生理和病理条件下结肠黏膜的完整性和稳态是如何维持，以及结肠癌细胞是如何生存和发展的。

参考文献
Siying Li, Ran Lu, Linjuan Shu, et al. An integrated map of fibroblastic populations in human colon mucosa and cancer tissues. Communications Biology. 2022.

英子李

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