转录组学干货 | 转录组测序技术流程介绍

我叫唐三藏

之前简单对转录组的相关知识进行了一个简单的介绍，今天再给大家介绍一下转录组测序技术相关的内容。

首先我们再来简单回顾一下转录组测序的定义：
转录组（Transcriptome）是指细胞所能转录出的所有信使 RNA（mRNA）的集合。
转录组测序（mRNA Sequencing，mRNA-Seq）是使用高通量测序技术，在给定时刻从一个基因组中，揭示 RNA 的存在和数量的一个快照的技术，为生命科学研究提供了全新的角度，可用于预测基因结构、可变剪切和其他转录修饰，并可定量测定每个转录本在生长过程中和不同条件下表达水平的变化。
了解完什么是转录组测序后，大家肯定想知道转录组测序技术具体有哪些流程对不对？
别着急，让我们一起“走进”转录组测序技术！
转录组测序技术流程总的来说可以分为6个部分，技术流程图如下：


接下来就给大家介绍一下各个流程的具体情况。

样本要求


建库流程
1总RNA提取
提取后的总RNA要进行纯度(purity)、浓度(quantity)、完整性(RIN)的质量检查。
不同样品的total RNA中mRNA含量差异较大，若total RNA起始投入量过低，不能保证有足够的mRNA用于后续建库，因此建议RNA起始量为1～4μg。

2mRNA分离与片段化
分离：因为真核生物成熟mRNA有ploy（A）尾，所以可以用oligo dT磁珠与mRNA的poly（A）尾特异性结合从而去除其他RNA。
片段化：用试剂（fragmentation reagent）将纯化的mRNA片段化。

3cDNA第一链合成
随机六聚体引物（random hexamer primer），逆转录酶以mRNA为模版合成cDNA。

4cDNA第二链合成
第二链合成并删除mRNA，产生双链cDNA（ds cDNA）。
纯化双链cDNA
5双链cDNA的末端修复
末端补齐，再纯化修复后的cDNA。ds cDNA3‘端加A（dA - tailing）。

6连接接头
每个接头都有一个index，不同的文库构建可以使用不同的index。
可以这么理解：有很多个样品，每个样品用不同index接头建库，这些文库可以混在一起（混之前要归一化）拿去同一个lane中测序，再根据index区分出来。
然后纯化连接了接头的 ds cDNA

7PCR富集文库
如图一，PCR扩增时所用的引物上有P5、P7引物和 barcode；扩增完纯化后，进行文库质检，质检完的文库就可以拿去上机测序了。
上机测序结束后拿到原始数据，我们会对原始数据进行生信分析，分析流程图如下：


生物信息分析具体实施过程如下：

1数据质控 ：
测序数据的质量是信息分析结果可靠性的重要前提，对于下机数据需要进行严格的质控过程来获取高质量的测序数据。

2参考基因组比对：
从各样品质控后的 Clean Data 出发，将 Clean Data 比对到参考基因组并进行比对结果的统计。

3基因表达定量：
根据比对结果进行基因的表达定量，基因定量主要研究各基因的测序序列覆盖情况 ( Reads Count )。

4差异基因分析：
基于基因表达定量结果进行样本或分组间差异基因的分析，获得样本或分组间的差异表达基因，这是下游分析和数据挖掘的重点。
5功能富集：
基于样本或分组间差异基因，通过功能注释数据库，如 GO 、 KEGG 和 STRING 等获取显著富集的功能信息和蛋白互作信息。

6变异检测：
基于转录组数据进行 SNP 、Indel 、可变剪接和融合基因等变异的检测和注释，在转录组层面挖掘与疾病或表型相关的信息。
生物信息分析具体实施过程如下：
1
数据质控 ：
测序数据的质量是信息分析结果可靠性的重要前提，对于下机数据需要进行严格的质控过程来获取高质量的测序数据。
2
参考基因组比对：
从各样品质控后的 Clean Data 出发，将 Clean Data 比对到参考基因组并进行比对结果的统计。
3
基因表达定量：
根据比对结果进行基因的表达定量，基因定量主要研究各基因的测序序列覆盖情况 ( Reads Count )。
4
差异基因分析：
基于基因表达定量结果进行样本或分组间差异基因的分析，获得样本或分组间的差异表达基因，这是下游分析和数据挖掘的重点。
5
功能富集：
基于样本或分组间差异基因，通过功能注释数据库，如 GO 、 KEGG 和 STRING 等获取显著富集的功能信息和蛋白互作信息。
6
变异检测：
基于转录组数据进行 SNP 、Indel 、可变剪接和融合基因等变异的检测和注释，在转录组层面挖掘与疾病或表型相关的信息。
生信分析结束后，小伙伴们能拿到转录组测序的所有结果，但是你们不会以为拿到结果就结束了吧，没那么简单，拿到结果只是一个开始哦，离文章发表还有好多“大山”在等着各位去探索、攀登，比如说后续的数据深入分析，差异基因的挑选、数据结果的验证等等

小心有毒

大人，此事必有蹊跷！